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空气微生物群落样品采集、解析方法及研究进展_樊晓燕,高景峰

目前,454 和Illumina 测序技术在研究空气微生物群落组成方面的应用最为广泛。Bowers 等[37]利用454 测序技术对美国中西部4 个城市夏季和冬季近地面PM2. 5样品中的细菌群落结构
下载次数:676 浏览次数:1428发布时间:2018-04-29 16:46
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空气微生物可以吸附在细小的颗粒物表面,从而较长时间停留在空中,形成灰霾天气。到目前为止,空气微生物的研究已有约180 年的历史[9]。1983 年,Jones 等[10]发现空气微生物能够导致人类、动物和植物疾病的传播,威胁人健康。1997 年,Fuzzi 等[11]进一步发现了空气微生物具有代谢活性。在国内,谢淑敏[12]和张素琴[13]等基于传统的培养方法对京津地区的空气微生物进行了初步研究。近年来,随着高通量测序技术的出现,其通量大、速度快等优点,显著提高了空气微生物的研究深度。2009 年,Bowers 等[14]首次利用454 高通量测序技术对美国科罗拉多西北部一个高海拔地点的空气微生物群落进行了研究。细菌是空气微生物的主要组成部分,在空气中广泛存在且丰度高[15-16],其中,少部分细菌是潜在致病菌,是造成医院感染的重要因素[17],成为空气微生物研究的焦点。因此,本文综述空气微生物的采样方法和群落解析方法,并对其中细菌群落的研究进展进行重点综述,以期为空气微生物污染的控制及有针对性地制定相关治理措施提供论依据。1 空气微生物的采样方法微生物采样方法的选择是研究空气微生物群落的第一步。目前,关于空气微生物的采样并没有统一的标准。空气微生物的采样方法较多,不同采样器各具优缺点,主要依据研目的选择合适的采样方法。除此之外,在选择采样器的候还需考虑以下关键因素,如采样效率、采样灵敏度、操作的方便性、微生物的存活率、不同粒径的区分及价格等。总的来说,空气微生物的采样可以分为四大类,即惯性撞击类、过滤阻留类、静电沉着类和温差迫降类,其中前两类用的较多[18-20]。图1 空气微生物采样方法Fig. 1 Sampling methods f airborne microorganisms图1 对不同采样方式的特点进行了比较[18-20]。惯性撞击类主要分为自然沉降法、射流撞击式采样和离心撞击式采样。其中,自然沉降法是最简单、成本低的方法,主要利用重力沉降的作用收集空气微生物颗粒,但是由于空气流量未知,不能用于定量测定。射流撞击式采样器,可分为固体撞击式采样器和液体撞击式采样器。这类采样器主要利用抽气装置以恒定的空气流量采集颗粒物,可以用于空气微生物的定量测定。固体撞击式采样器流量的变化范围为10 ~ 700 L/min;而液体撞击式采样器的流量较小,一般在12 ~ 20 L/min,其用于高浓度的空气微生物采样,可测定空气中活性微生物的数量,但是不适于低温和长时间采样。离心撞击式采样器结构简单、体积小,对于细菌、真菌和病毒的捕获效率较高,但其有效采气量未知,也不能用作定量测定。过滤阻留类采样利用抽气装置,使空气微生物颗粒被截留在不同的滤材上,可以分为深层过滤和膜式过滤两类,前者的滤材为纤维型或颗粒型滤料,后者是可溶性或不溶性的滤膜。这类采样器可在低温下进行采样,采集效率高,能够实现其基本原理是通过将空气微生物采集到特定的采样介质上,经过培养繁殖生长成菌落后计数,然后进行分离和纯化,结合微生的形态构成、生理生化特征等实现对物种的分类鉴定[22]。在早期的研究中,国外一些研究学者使用传统培养方法研究空气微生物,如Lindemann[23]、Lighthart[24Shaffer[25]等。20世纪90 年代,国内相关研究逐渐兴起,相关的研究人员有胡庆轩[26]、方志国[27]、谢淑敏[12]、凌琪[28]等。传统的培养方法对于空气微生物的研究是一个很好的方法,够为世界范围内空气微生物基础数据的储备提供基础。同时,传统的培养方法可以用来分离微生物菌株,是研究细菌生理和代谢特性等方面信息的最直接有效的方法[19,21,29-30]。但是,由于活的可培养的微生物占所有微生物的比例不超过1%[29],大部分微生物是不能被培养的,采用传统的培养方法得到的微生物群落分布的信息极其有限,常会低估空气微生物的多样性,导致大量重要微生物被忽略或遗漏。与传统的培养方法相比,非培养的方法基于基因组DNA,能够较全面分析空气微生物的群落组成,提高了研究的广度和深度。随着研究的深入,非培养的方法分为传统的分子物学技术和高通量测序技术两大类。传统的分子生物学技术主要包括聚合酶链式反应( Polymerase Chain Reaction,PCR) [31]、变性梯度凝胶电泳技术( Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE) [31]、末端限制性酶切片长度多态性分析( Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism,T -RFLP) [32]和克隆( Clone) 文库[33]等。近年来,这些技术已越来越多用于空气微生物多样性的研究中。Li 等[34]利用PCR- DGGE 研究了近地面和高海拔采集的TSP 样品中细菌群落的差异。Lee 等[32]利用T - RFLP 对首尔空气中细菌和真菌的群落结构进行了研究。Jeon 等[35]利用克隆和DGGE 手段研究了亚洲沙尘对于空气细菌群落的影响。但是,这些技术流程复杂,费时费力,通量低,测序成本高,在研究空气微生群落方面存在一定的局限性。高通量测序技术的出现,大大高了环境微生物研究的深度。该技术具有数据产出通量高、价格便宜、速度快等特点[36]。目前,高通量测序技术以Roche公司的454、Illumina公司的Solexa 和Life Technologies 公司的SOLiD、Ion Torrent等为主[36]。454 测序是以DNA 乳胶扩增系统和焦磷酸为测序的基础,因此,也被称为“焦磷酸测序”[36]。Illunima 公司的HiSeq 和MiSeq 测序平台是基于Solexa 技术开发的,其特有的可逆终止子设计,减少了碱基的重复掺入,保证了测序的准确性[36]。目前,454 和Illumina 测序技术在研究空气微生物群落组成方面的应用最为广泛。Bowers 等[37]利用454 测序技术对美国中西部4 个城市夏季和冬季近地面PM2. 5样品中的细菌群落结构进行了研究。Robertson 等[38]利用454 测序技术对美国纽约城市地铁中的生物气溶胶的微生物群落进行了研究。Bertolini 等[39]采用Illumina 测序技术研究了意大利米兰城区交通密集区附近TSP 样品中的空气微生物分布。Mazar 等[40]利用Illumina 测序技术研究了地中海东部沙尘过程对于PM10中微生物群落的影响。此外,近年来的宏基因测序技术和基因芯片技术也被用来研究空气微生物的群落组成[21,41]。3菌Bacillus) ,葡萄球菌属( Staphylococcus) 和假单胞菌属( Pseudomonas) 是优势属。此外,微小杆菌属Exiguobacterium和链霉菌属( Streptomyces) 在珠江三角洲城市空气中被检测到,奈瑟氏菌属( Neisseria meningitides也是上海城区的空气微生物中的优势属。这些研究表明,70% ~ 90%的细菌都属于革兰氏阳性菌,与国外的一些研究相一致[45-46]。但是,Diiorgio 等[47]研究表明,基于培养方法得到的细菌其中60%以上为革兰氏阴性菌,与大部分研究结果不同。大部分研究结果都表明革兰氏阳性菌是空气中主要的细菌,主要是由于它们的孢子对于大气环境中的高太阳辐射和干燥等恶劣环境的耐受性更强[19]。总的来说,由于传统培养方法本身的局限性,相应的研究结果可能存在很大偏差。3. 2 基于高通量测序技术高通量测序技术的通量大,可以检测到丰度极低的微生物,明显提高了空气细菌的研究深度。表2 对近年来基于高通量测序技术的空气微生物群落的一些重要研究进行了总结。由于样品采集方法、群落解析手段及统计方法不同,导致不同研究结果的可比性较差,需要对不同研究进行分类比较。目前,关于空气细菌的研究主要集中于以下4 个方面: 1) 空气细菌群落的空间和时间变化; 2 ) 特殊事件对空气细菌的影响; 3) 探究空气细菌的主要来源; 4 )环境变量和气象因素与空气微生物群落的关系,下别进行综述。表2 基于高通量测序技术的空气细菌的群落组成Table 2 Airborne bacterial communities based on high-throughput sequencing2018 年2 月樊晓燕,等: 空气微生物群落样品采集、解析方法及研究进展Feb. ,20183. 2. 1 空气细菌群落的空间和时间变化从表2 可以看出,前人主要利用454 和Illumina 技术研究了不同城市( 如美国中西部、意大利米兰和香港等) 、不同季节、不同粒径颗粒( PM2. 5、PM10或TSP) 、不同地理利用类型、不同海拔高度空气中细菌的群落组成。不同地点、不能海拔高度、不同土地利用类型空气中细菌的主要组成相近,其中,变形菌门( Proteobacteria) 、放线菌门( Actinobacteria) 、拟杆菌门( Bacteroidetes) 、厚壁菌门( Firmicutes) 门( Cyanobacteria)是空气细菌的优势门[14,37-38,48-49,51-52]。这些细菌大都属于革兰氏阴性菌,与传统培养方法的革兰氏阳性菌结果完全不同。但是,Bowers 等[49]的研究也表明,空气细菌群落与不同地点土地利用方式明显相关,放线菌门( Actinobacteria) 是农田和郊区的优势门,而根瘤菌目( Rhizobiales) 是森林的优势细菌。造成这种差异主要是由于不同利用方式下细菌来源不同,采样期间细菌的来源直接决定了空气中细菌群落的多样性,这与Bertolini 等[39]的研究结果一致。此外,空气细菌存在一定的季节变化。Bowers 等[37]研究发现,变形菌门是夏季细菌群落的优势门,而厚壁菌门和梭杆菌门( Fusobacteria)是冬季细菌的优势门。在目水平上,Pseudomonadales)、伯克氏菌目( Burkholderiales) 、根瘤菌目Rhizobiales)和鞘脂单胞菌目( Sphingomonadales) 是夏季的主要细菌,而拟杆菌目( Bacteroidales) 和Clostridiales) 是冬季优势细菌。3. 2. 2 特殊事件对空气细菌群落的影响对于特殊事件,如雾霾过程和沙尘过程中空气细菌群落的研究及其与非霾天和非尘天气的差异也是研究的重点,对于探究雾霾和沙尘天气的形成机理及评估其影响,具有重要意义。Cao 等[21]在雾霾天气利用宏基因组研究了PM2. 5和PM10中微生物的种群分布特征。研究表明,细菌群落组成在雾霾过程中并未发生明显的变化,放线菌门( Actinobacteria) 、变形菌门( Proteobacteria) 、绿弯菌门( Chloroflexi) 、厚壁菌门( Firmicutes) 和拟杆菌门( Bacteroidetes) 是主要的细菌门。但是,该研究中发现了一些潜在致病菌,其相对丰度在整个雾霾过程中发生了变化。例如,发现的肺炎链球菌,是引发社区得性肺炎的常见菌种,其在PM2. 5和PM10中所占的比例分别为0. 012%和0. 017%,随污染过程加重,其比例不断升高,从0. 024%增加为0. 050%。空气细菌群落在沙尘过程中发生了明显变化。Mazar等[40]研究了地中海东部沙尘过程细菌群落的变化,发现芽单胞菌门( Gemmatimonadetes) 、红杆菌纲( Rubrobacteria) 、弗兰克氏( Frankiaceae) 和鱼孢菌科( Sporichthyaceae) 是沙尘天气的主要细菌,而在非沙尘天气,细菌主要属于皮菌科Dermabacteraceae) 和乳杆菌科( Lactobacillaceae) 。Polymenakou等[53]对克里特岛( 希腊) 沙尘事件中空气细菌组成的研究发现,在粗粒子中,细菌主要属于厚壁菌门( Firmicutes) ,而在细粒子中,其逐渐被放线菌门( Actinobacteria) 所替代。Jeon等[54]的结果表明沙尘天和非沙尘天空气细菌组成存在明显的差异。沙尘天气,厚壁菌门( Firmicutes) 是细菌的优势门,在总序列中的占比高达53%,而在非沙尘天气,细菌主要属于变形菌门( Proteobacteria) 。3. 2. 3 空气细菌的主要来源究空气中细菌群落结构还可以用来预测空气细菌的来源。前人的一些研究表明: 颗粒物中丰度最高的微生物可以作为推测空气细菌来源的指示,并通过这些指示微生物来考察不同来源的相对贡献[39]。但是,在细菌溯源分析中,是否将叶绿体( Chloroplast) 序列包含在序列分析中,依然是一个有争议的问题。由于叶绿体16S rRNA 基因与细菌16S rRNA基因有一定的重合,其在高通量测序中会占据一定的比例。Brodie[55]、Fahlgren[56]、Franzetti[50]和Bertolini[39]等把叶绿体序列包含在内,主要是由于植物是空气生物的主要来源,包含叶绿体序列对于探究空气微生物来源具有一定的帮助。而其他一些研究,如Jeon[54]和Maron[57]等将叶绿体序列排除在外,因为叶绿体毕竟不是细菌的组成部分。Bertolini 等[39]从米兰采集40 个颗粒物样品,并用Illumina进行测序分析,结果表明,土壤和植物是空气细菌微生物群落的主要来源。Bowers 等[49]的研究表明,土壤和植物落叶是空气细菌的主要来源。除了土壤和植物外,动物粪便,尤其是狗的粪便,也是PM2. 5样品中细菌的主要来源[37]。在大陆和温带地区,不同的研究都表明,植物是空气细菌的主要来源,尤其是在温暖的季节。Fahlgren 等[56]的研究结果表明,在温暖季节,植物相关的细菌及叶绿体的序列在总序列中所占的比例极高,而在寒冷季节,空气细菌只要是一些土壤相关的细菌。此外,还可以通过后向轨迹来分析空气细菌的来源。3. 2. 4 环境变量和气象因素与空气微生物群落的关系空气微生物学的另一大目标是研究影响空气细菌群落结构的环境因子和气象条件。目前,只有极少数研究考察了单一气象因子的影响[52,55,58]。空气温度是影响不同环境微生物群落的重要影响因子。Maron 等[58]研究结果表明,温度和相对湿度对于法国南锡城市空气细菌群落结构季节变化的贡献最大。Bowers 等[52]研究结果表明,温度是空气细菌群落结构的唯一影响因素,尤其对于春季和秋季季节间的变化的影响最大。此外,许多研究结果也表明,空气细菌群落的空间时间变化主要是由其他一些环境变量引起的,如气象因子( 除温度外) 、颗粒物中的化学成和空气微生物的主要来源[55]。因此,环境因子与空气细菌群落结构的关系依然不清楚,还有待进一步研究。3. 3 展望针对目前研究中存在的不足,空气微生物未来可深入研究的有以下几方面。1) 统一采样标准,开发更高效合理的空气微生物采样器,使采样更能反映原位状态。2) 完善空气微生物基因组DNA 提取的方法,为后续群落鉴定提供保障。3) 空气微生物的空间和时间变化研究。扩大空气微生物研究范围,如全国范围、城市站和背景站的对比研究、不同生态功能的空气微生物的研究等; 考察空气微生物长时间( 如5 a、10 a) 变化规律。4) 加强特殊污染事件中空气微生物的研究,探究雾霾形成的生物学机理,有针对性的提出治理措施。同时,有必要开展雾霾过程中潜在致病菌的研究,对于评估污染过程对于人体健康的影响具有重要作用。5) 进一步探讨空气微生物与环境因子,如温度、相对湿度、风速、PM2. 5及其中物理化学成分和气态污染物之间的内在联系,初步确定空气微生物污染的形成机制。360Vol. 18 No. 1 安全与环境学报第18 卷第1 期6) 空气微生物的粒径布特征尚不清楚,有必要通过多级采样器,采集分级颗粒物,系统研究微生物的粒径分布特征,有利于全面评估其对人体健康的危害。4 结论空气微生物能够导致人类及动植物疾病的传播、工农业产品的腐烂变质,影响人体健康和经济发展。严重雾霾的快速形成和扩散与其中微生物的快速繁殖密切相关,研究空气微生物具有重要的意义。目前,相关研究还处于刚刚起步阶段,仍存在许多问题: 1) 采样技术的标准不统一,常用的采样技术,虽对颗粒物的捕获效率高,但在反映其原始状态上存在一定缺陷; 2) 采集的颗粒物质量较少,很难从其中提取高质量、高浓度的DNA 样品,在一定程度上限制了后续微生物分析的准确性; 3) 空气微生物的研究主要集中于城市地区,研究面太窄; 4) 空气微生物时间上的变化大多关注于其季节变化; 5) 特殊污染事件中空气微生物的研究有待进一步加强;6) 空气微生物与环境因子之间的关系仍不清楚。

 

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