山东农业大学博士学位论文动物舍内微生物气溶胶及其向周围环境的传播摘任石丈微生物是动物舍环境污染的主要因素,动物舍的生物污染可以引起一系列传染病的流行。近几年的研究表明,一些气载病原微生物能够通过空气传播很远的距离,造成传染病的流行。过去对畜禽养殖环境微生物气溶胶的传播主要是通过舍内外环境中的细菌浓度的变化以及细菌耐药性及某些致病菌含量等方面来确认的。然而,未能证明舍内外环境分离的微生物气溶胶的起源及其同源性,没能获得充分的证据证明畜禽舍微生物气溶胶向环境的传播。因此,本课题测量了个动物舍个鸡舍、个猪舍、个牛舍和个兔舍舍内及舍外不同距离上风、和下风、、、、的大肠杆菌和肠球菌含量,在此基础上,统计舍内、舍外气载需氧菌的含量对大肠杆菌的耐药性及其肠毒素的检测采用分子生物学方法一和一对不同地点分离的大肠杆菌和肠球菌的遗传相似性进行比较对肠球菌的耐药基因进行了检测。根据以上结果确定动物舍微生物气溶胶的危害性及其向环境中的传播。动物舍内微生物气溶胶的含量及其向舍外环境的传播本试验采用一级空气微生物样品收集器和离心式采样器在个动物舍舍内空气、舍外上风、和下风、、、、不同距离收集物气溶胶,一方面,通过对动物舍环境中气载需氧菌含量、气载大肠杆菌含量、气载肠球菌含量的检测,以及它们在六级采样器上的分布规律来推断其对饲养员及动物自身可能造成的危害,从而使人们对动物产生的微生物气溶胶及其健康威胁的高度重视另一方面,通过对畜禽舍内、外需氧菌含量的比较分析,从而初步观察菌群随着距离增长变化的规律。研究结果表明,在所有检测的养殖环境中微生物气溶胶粒子浓度要远远高于一般的原野环境,而且大部分粒子的空气动力学直径较小,更容易进入呼吸道深部。虽然我们没有对养殖环境的动物及饲养员的健康作系统的调查,但是长期处在这种高浓度的微生物气溶胶环境下,对动物体和饲养人员感山东农业大学博士学位论文进行同源性比较鉴定,一方面,可以验证两种方法的可靠性另一方面,为研究猪舍养殖环境产生的大肠杆菌气溶胶向其周围环境的传播提供可靠的方法。在本实验中,我们分析了从个猪舍环境中分离到的株大肠杆菌,一和两种方法都显示出了很高的菌株间的区分性。一表现出的指纹图谱与表现出的指纹图谱显示出极高的相似性,从而也说明了这两种方法的可靠性。结果表明,有的从粪便中分离的大肠杆菌与舍内空气或舍外下风分离的大肠杆菌的相似性,然而从上风方向分离的大肠杆菌与舍内空气或粪便中分离的大肠杆菌的相似性较低一。可见,很多从舍内空气和舍外下风方向分离到的大肠杆菌来源于动物的粪便。动物舍环境大肠杆菌主要毒力基因的检测及其向舍外环境传播的鉴定本研究采用多重方法分别对个鸡舍及其周围环境中分离到的株大肠杆菌,个猪舍及其周围环境中分离到的株大肠杆菌和个牛舍及其周围环境中分离到的株大肠杆菌进行了种不同的毒力基因、、、饮和的多重检测,不仅调查了不同动物舍舍内环境中大肠杆菌的种主要毒力基因的携带情况,而且还通过对舍内、舍外环境中大肠杆菌的种主要毒力基因的比较检测分析,研究舍内大肠杆菌中主要毒力基因向舍外环境中的传播。结果表明,不同的动物舍环境中大肠杆菌其携带的种毒力基因型虽然不同,但是都有一定量的大肠杆菌携带毒力基因,而且很多是携带种或种以上的毒力基因,这些致病性大肠杆菌可以通过舍内外气体的交换而传播到舍外环境。一对动物舍内气载肠球菌向舍外环境传播的鉴定为了给畜禽舍微生物气溶胶的产生与传播提供更充分的证据,以另一种微生物一肠菌作为指示菌,以一方法来研究三种动物舍鸡舍、猪舍和牛舍环境中气载肠球菌向舍外环境中的传播,从而与大肠杆菌作为指示菌来做对比,进一步证明动物舍舍内微生物气溶胶向舍外环境传播的必然性,同时也证明了以肠球菌作为指示菌研究微生物气溶胶在环境中传播的可行性。通过对个不同的鸡舍株、个不的猪舍株以及个不同的牛舍株舍内及其周围环境中肠球菌同源性的一分析,结果表明,动物舍内动物的粪便中的肠球菌可以不断形成气溶胶,不仅在能够在舍内空气中传播,而且还能够随着气体的交换而传播到舍外较远的距离,特别是下风方向。上风和舍外下风方向不同距离空气中需氧菌的浓度尸,该结果表明,舍内微生物气溶胶含量较高,随着舍内外气体的交换而不断传播到舍外一定距,特别是下风内。另外,下风不同距离细菌浓度与上风处一般原野比较,差异显著尸,舍外下风方向在、和鸡舍和牛舍除外之间需氧菌的浓度差异不显著尸,表明气载需氧菌在一定的气象条件下也可以传播到舍外下风较远的距离〕。班一对鸡舍和牛舍环境中气载大肠杆菌向舍外环境传播的鉴定本课题测量了个鸡场和个牛场舍内及舍外不同距离的大肠杆菌含量,在细菌学鉴定的基础上,采用犯一方法对不同地点分离的大肠杆菌鉴定其同源性,获得大肠杆菌片段指纹图谱,通过该片段在细菌基因组内的数量和分布之间的关系,比较其遗传相似性,确定动物舍微生物气溶胶的向环境中的传播。一结果表明,从动物的粪便中分离到的大肠杆菌与从舍内空气中分离到的部分大肠杆菌鸡舍为牛舍为相似性可达,从动物舍外下风方向、、和分离到的多数大肠杆菌鸡舍为牛舍为与舍内空气或粪便中分离的大肠杆菌相似性可达。而从动物舍上风分离到的大肠杆菌与舍内空气或粪便中分离的大肠杆菌相似性较小。所以,得出结论,从上风分离到的多数大肠杆菌并非来源于动物的粪便或者舍内空气,而很多从舍内空气和舍外下风方向分离到的大肠杆菌来源于动物的粪便,说明源于动物舍的微生物气溶胶能够通过舍内外气体交换传播到舍外,依气象条件传播到舍外不同的距离,造成周边环境的生物污染以及病微生物的扩散。舍环境中大肠杆菌耐药性向舍外环境传播的鉴定过对同一鸡舍内外环境中大肠杆菌耐药性的调查、分析,证明鸡舍内环境中的大肠杆菌可以通过舍内外气体的交换而传播到舍外环境中去,可能对附近养殖场及其周边居民的健康构成潜在的威胁。结果表明,鸡舍粪使中及舍内、舍外空气中分离到的大肠杆菌都对一和完全耐药对和都敏感,并且没有发现对这两种药物的耐药菌株。特别是从舍外下风方向上分离到的菌株对药物的敏感性与从舍内空气中或者是鸡的粪便中分离到的大肠杆菌的耐药性基本一致,说明这些耐药菌株来源于动物舍,它们能够从舍内向舍外环境传播。一和一对猪舍环境气载大肠杆菌向舍外环境传播的鉴定采用班一和一两种方法进一步对同一猪舍不同地点分离到的大肠杆菌动物舍内微生物气溶胶及其向周围环境的传播动物舍环境气载肠球菌主要耐药基因的检测及其向舍外环境传播的鉴定为了了解当前养殖环境中细菌的耐药现状,仍以肠球菌为指示菌,通过对该菌的耐药性调查,了解不同场的药物使用状况,细菌耐药谱及其程度,为此后用药提供指导。通过对不同动物舍环境中分离的肠球菌对四环素类、氨基糖贰类抗生素大霉素及糖肤类抗生素万古霉素和主要耐药基因的检测,目的了解当前养殖环境中肠球菌的耐药现状,并为以后的用药提理论基础通过对舍内、舍外不同环境中采集到的肠球菌主要耐药基因的检测与比较,研究耐药肠球菌在动物舍舍内及其周围环境中的播。结果表明本研究通过对个动物舍株肠球菌耐药基因的检测,动物舍环境中存在一定比例的,对一内酞胺酶耐药肠球菌三种动物舍舍内及其舍外环境分离株都存在不同程度的对四环素类抗生素的耐性,而且,耐药率较高。其中,鸡舍粪便分离株肠球菌的检出率最高,其次为猪舍粪便分离株有很少几株肠球菌携带和基因,但是,也存在少量的阳性菌株,这是在动物舍环境中首次检测到,所以应当引起我们足够的重视绝大多数肠球菌携带基因的一种或几种,只有的肠球菌不携带基因,可见,鸡、猪、牛舍环境中的肠球菌对氨基糖昔类抗生素耐药的普遍性同时,统计结果也可以看出,大多数肠球菌都携带种或种以上的基因,最多者可以携带种基因,一”,一卜`一”一一,可见,肠球对庆大霉素类抗生素耐药的严重性。因此,在兽医临床诊断以及治疗的过程中不得不引起我们足够的重视。通过对鸡、猪、牛舍舍内动物粪便和舍内空气及其周边环境中上风方向、,下风方向、、、、肠球菌耐药基因,,和,的检测结果比较后可以看出,舍外环境中的,特别是下风方向分离到的很多肠球菌其携带的耐药基因类型与舍内或动物粪便中的肠球菌其携带的耐药基因类型相同。因此,结合一同源性分析结果,句以确定肠球菌耐药性也可以在舍内及其周围环境中传播。关键词动物舍微生物气溶胶班一一相似性鉴定毒力基因染压增大,导致很大的感染风险,能够产生有明显临床症状的传染发生,或隐性感染,或发展为慢性呼吸道疾病以及继发感染等,该领域还有待于进一步研究通过比较舍内外的气载需氧菌的含量发现,动物舍舍内气载需氧菌含量远远高于动物舍微生物气溶胶概述微生物气溶胶的概念气溶胶是固态或液态微粒悬浮在气体介质中的分散体系。微生物以单独单细胞悬浮状态、与干燥固体颗粒尘埃、液体微粒液体小滴相连接在空气中悬浮就形成生物气溶胶,又称微生物气溶胶,车凤翔,。微生物气溶胶中的粒子种类非常多,包括病毒、细菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体、真菌等。微生物气溶胶以微生物的种类可分为细菌气溶胶、病毒气溶胶、真菌气溶胶九等。自年美国实施“气溶胶感染”计划以后,生物气溶胶的研究在理论和技术上均有突破性进展。只是到了年代,有关畜牧业方面的气溶胶研究才得到发展。微生物气溶胶的特微生物气溶胶从形成到引起感染是由它的特性决定的。来源的多相性报道微生物气溶胶它可以源于水体液体、大气气体、土壤固体及动物、植物和人体组成的自然界。它们之间又可进行交换,使问题更加复杂。植物空气中的某些细菌、真菌、病毒来源于植物,植物能向空气释放大量的细菌,在围场麦田上方空气中细菌浓度为,,。植物表层的病毒可由风力或其他动力带入空气造成植物空气传播感染,。动物及畜牧业生产动物本身带菌严重,例如狗有携带金黄色葡萄球菌,牛、羊和其他一些反色动物可从胃排出大量微生物气溶胶,国外已有人在禽舍内外空气中采到了鸡新城疫病毒和其他致病微生物鸭场的空气细菌浓度可高达每数万个牛棚内外烟曲霉抱子高达每立方米集落形成单位,这种情况下,易感动物容易接受病原而感染患病,进而成为传染源引起流行病。二个动物的每次喷嚏散发到空气中多个含有微生物的微滴,有时多达个。在畜禽舍中,由畜禽排出的微生物、饲料、饮水、垫草中的微生物经过风化、腐蚀或者磨耗的过程,通过空气气流弥山东农业大学博士学位论文散,与水、尘埃颗粒相结合,悬浮在空气中形成气溶胶,。现代化动物养殖场饲养密度高,舍内空气流动性较差,湿度大,缺乏直射阳光,有利于微生物的存活和繁殖,是微生物气溶胶种类多、含量高、难控制的重点场所。据报道,动物舍空气中含有链球菌、葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和魏氏梭菌等致病菌和鸡新城疫、禽流感、马立克氏病等病毒,这些微生物可导致畜禽多种疾病,尤其是呼吸道疾病,柴同杰等,。对病死畜禽处理不当也可能在附近形成气溶胶,引起疾病传播,据报道在掩埋死亡动物的地域放映电影,发生了吸入性肺炭疽。人类及其生产活动人类是许多场所特别是公共场所空气微生物的来源。一个正常人在静止状态每分钟向空气排放一个细菌,活动时排放量多达成千上万,每次咳嗽或打喷嚏可排放一个带菌颗粒,即使是大声说话也排放大量微生物气溶胶车凤翔等,。许多微生物气溶胶来源于各类生产活动,除了农业、林业、畜牧业生产活动可产生大量的微生物气溶胶外,许多工业生产活动如发酵、制药、食品、制革和毛纺织生产均造成空气微生物污染,并导致严重后果。报道,美国屠宰场空气中存在大量的布氏杆菌,并造成例布氏杆菌病的严重后果,证明,美国一些毛纺厂空气中有大量的炭疽芽胞,曼彻斯特某工厂每人每吸入炭疽芽胞粒子达一个。污水污物处理城市生活污水,动物养殖场、屠宰、制革及洗毛厂等排出的污水都溶有大量微生物,水中的微生物可随水花溅起和泡沫形成等过程形成气溶胶。某污水处理厂反应池、污泥浓缩池、厂前区的空气均可采集到正常区域不易收集到的金黄色葡萄球菌、绿色链球菌、大肠杆菌、不动杆菌属、变形杆菌等,认为厂区空气已受到污水处理过程中产生的微生物气溶胶的污染余贵英等,。生活垃圾和动物粪便都含有大量的细菌、寄生虫及其卵甚至病毒,垃圾处理过程能杀死其中的绝大部分微生物和寄生虫及其卵,但在暴露、翻动、分散和集中等过程中都可能产生微生物气溶胶。柴杰报道,某生物垃圾加工厂供料厅气载需菌总数浮动于一,厌氧菌为一。自然界开空气,也就离不开微生物气溶胶。呼吸道的易感性、人和动物接触微生物气溶胶的密切性和频繁性决定了感染的广泛性。微生物气溶胶的成分及所造成的危害空气是人类和畜禽赖以生存的重要因素之一。薇生物对人类和畜禽健康及生产能的影响在很多情况下是通过空气污染造成的,空气微生物的污染程度是衡量空气质量的重要标志之一。空气本身并不具有固定的微生物群系,它只是由于种种原因暂时进入空气中的过客车凤翔,。但是由于人类和畜禽活动的参与,使得微生物在畜禽舍内空气中形成一个相对稳定的存在形式。目前人们评价空气质量状况有多种方法,如通过测量空气中有害细菌含量及组成诚,,,,测量某种致病菌含量屈凤琴,测量空气中有害气体含量,等方法。微生物的含量多少及组成成分,特别是某些致病性微生物的存在如致病性大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等,是导致空气污染和引起动物甚至人类发病的重要原因。空气中极少量的病原微生物就可以直接导致畜禽的呼吸道感染,尤其是下呼吸道感染一定含量的选择性病原微生物在适宜的条件下致病高浓度的非病原微生物导致机体免疫负荷过重,抵抗力降低,易感性升高,。研究证明,畜的许多烈性传染病大都是气源性传染病,病原借助于空气或以空气为媒介传播。因此,研究空气中微生物的含量及组成,也是评价空气质量状况的一种有效的方法。此领域的研究在国内外都有,但是国内的研究水平及深度要远远落后于国外。畜禽舍中生物气溶胶的成分研究畜禽舍微生物主要有细菌、真菌和病毒。在动物舍分离到的细菌主要有葡萄球菌、链球菌、需氧芽抱菌、肠杆菌等,有的动物舍还分离到厌氧芽抱菌,金色葡萄球菌、沙门氏菌、肠原性致病性大肠杆菌和产气英膜杆菌等致病菌也已得到证实。由于圈舍卫生状况不同,畜禽舍内的微生物含量显示了浮动值,禽舍空气细菌含量最高,特别是地面平养鸡舍,它的空气中细菌含量比其它动物舍高出千万倍,比居民区的浓度高出更多。微生物气溶胶造成的危害动物舍内微生物气溶胶及其向周围环境的传播微生物是动物舍环境污染的主要因素,动物舍的生物污染可以引起一系列传染病的流行。动物舍空气中的细菌包括致病菌、条件性致病菌和非病原菌,,它们在一定程度上均可导致动物或饲养员的感染,·,毋,,。甚至极少量的致病菌就可直接导致呼吸道的感染,特别是下呼吸道的感染卫,,。所以,空气中微生物气溶胶的污染不仅能够影响人及动物的健康,而且使一些传染性人兽共患疾病病原体在人和动物间的传播。微生物气溶胶对畜牧业的危害世界各国由于动物传染病造成的经济损失十分巨大,我国每年由传染病引起动物死亡造成的损失高达亿元。例如年北京某鸡场一次微生物气溶胶呼吸道传染病,致使万鸡发病,发病率达,病死率,产蛋率由下至,近年来,口蹄疫在欧洲、亚洲等地不断发生,笔者认为口蹄疫的大面积流行,其原因是口蹄疫病毒气溶胶可借助空气从一个牧场播到下风向一的另一牧场,造成流行,此外,炭疽杆菌芽胞也可在大气中悬浮较长时间并引起人畜吸入性炭疽流行。根据一年全国疫病普查结果,畜禽传染病有种之多,其中细菌性疾病种,病毒性疾病多种,真菌性疾病种。危害严重或局部发生但潜在危害性较大的有种。在这些畜禽传染病中,多数传播途径为气源性传播,如结核病、球抱子菌病、口蹄疫,霍乱、流感、新城疫、犬瘟热等,它们的病原微生物均能在空气中形成气溶胶,经呼吸道感染人畜。报道,以畜舍为污染源的口蹄疫病毒气溶胶在以内不沉降,且至少传播。报道,畜粪堆的大肠杆菌气溶胶在下风向空气中呈现阳性,而且随风速增大空气中细菌增多报道,烟曲霉气溶胶扩散到下风向,条件适宜可达,在此范围内的易感动物则容易被侵害而成为传染源,使流行病发生。微生物气溶胶是气源性传播的关键因素,气源性传染病不同于经其他途径传播的疾病,它们传播速度快,距离远,效率高,难于防御。等在一个由高的墙分隔成个猪栏的猪圈中以猪瘟病毒形成气溶胶,结果发现饲养在其中的猪只,有头立即感染,头后感染,另有头后感染。用李斯特氏菌通过皮下注射、消化道饲喂和气溶胶感染三种方法感染小白鼠,发现经呼吸道吸入气溶胶感染最有效。研究发现用新城疫气溶胶直接输入气管感染鸡,需要的量比通过消化道的量小倍。